Information

C3: Lipid Rafts - Biology


Not only are lipids asymmetrically distributed between leaflets of a bilayer, they are also distributed asymmetrically within a single leaflet. Certain lipids often cluster within a leaftlet to form lipid "rafts" which can be considered to result from a lateral phase separation of the lipids within one leaflet of the bilayer. Divalent cations like calcium, which can bind to negatively charged PLs like PS, can cause "rafts" of PS to form, giving rise to lateral asymmetry within a leaftlet of a bilayer. Rafts also appear to be enriched in cholesterol and lipids with saturated fatty acids, especially sphingolipids, which would lead to regions of enhanced packing and reduced fluidity. Cholesterol would stabilize packing in spaces created with lipids with large head groups.

Cholesterol appears to be a key player in the formation of lipid rafts. It is planar and inflexible and would pack better with saturated fatty acid chains and could also induced them to elongate to form lower energy zig-zag structures in which all the methylene groups are anti. Lipid rafts would represent a more ordered lipid phase (Lo) compared to the more disordered surrounding phase (Ld). Also compared to the structure of glycerophospholipids, the atoms in the region linking head group and the nonpolar fatty acid chains in sphingolipids have greater potential for H bond interactions with cholesterol and other sphingolipids, as shown below.

Figure: Comparison of glycerol and sphingosine headgroup structure

Rafts probably bind or exclude binding of other biological molecules like proteins. Some proteins are chemically modified with a glycosylphosphoinositol (GPI) group at the carboxy terminus. The PI group can insert into the membrane, anchoring the protein to the bilayer. Protein also appear to induce raft formation. Lipids rafts appear to be enriched in GPI-anchored proteins. Recent studies have shown that the Ebola virus interacts with lipid rafts in the process of entering and exiting the infected cell. Rafts are also involved in how cells sense and respond to their environment. Signaling molecules on the outside of the cell can bind receptor proteins in the membrane. As we will see later, conformational changes in the receptor protein signals the inside of the cells that the receptor is bound with a ligand. Once bound, the receptor can move in the membrane and often cluster in outer leaflet rafts that contain cholesterol and sphingolipids. Inner leaflet rafts have also been observed. The figure below shows two versions of an animated version of a lipid raft. The large shapes represent membrane proteins selectively found in the rafts (a topic which will be discussed in Chapter 2G). The most modern definition of a lipid raft is a nanoscale assemblies of sphingolipids, cholesterol and proteins that can be stabilized into platforms.

Figure: Lipid Rafts enriched in SM and Cholesterol (screen capture from: multimedia.mcb.harvard.edu/anim_innerlife.html )


Lipid raft involvement in yeast cell growth and death

The notion that cellular membranes contain distinct microdomains, acting as scaffolds for signal transduction processes, has gained considerable momentum. In particular, a class of such domains that is rich in sphingolipids and cholesterol, termed as lipid rafts, is thought to compartmentalize the plasma membrane, and to have important roles in survival and cell death signaling in mammalian cells. Likewise, yeast lipid rafts are membrane domains enriched in sphingolipids and ergosterol, the yeast counterpart of mammalian cholesterol. Sterol-rich membrane domains have been identified in several fungal species, including the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, the fission yeast Schizosaccharomyces pombe as well as the pathogens Candida albicans and Cryptococcus neoformans. Yeast rafts have been mainly involved in membrane trafficking, but increasing evidence implicates rafts in a wide range of additional cellular processes. Yeast lipid rafts house biologically important proteins involved in the proper function of yeast, such as proteins that control Na(+), K(+), and pH homeostasis, which influence many cellular processes, including cell growth and death. Membrane raft constituents affect drug susceptibility, and drugs interacting with sterols alter raft composition and membrane integrity, leading to yeast cell death. Because of the genetic tractability of yeast, analysis of yeast rafts could be an excellent model to approach unanswered questions of mammalian raft biology, and to understand the role of lipid rafts in the regulation of cell death and survival in human cells. A better insight in raft biology might lead to envisage new raft-mediated approaches to the treatment of human diseases where regulation of cell death and survival is critical, such as cancer and neurodegenerative diseases.

Keywords: S. cerevisiae cell death ergosterol ion homeostasis lipid rafts membrane domains nutrient transporters yeast.


Obsah

Jedním z klíčových rozdílů mezi lipidovými rafty a plazmatickou membránou, z které jsou rafty odvozeny, je jejich lipidové složení. Lipidové rafty obvykle obsahují 3 až 5násobné množství cholesterolu než okolní dvojvrstva. Jsou také obohaceny o sfingolipidy, jako je například sfingomyelin, kterého je zde typicky o 50 % více než v plazmatické membráně. Aby byl vykompenzován zvýšený obsah sfingolipidů, mají lipidové rafty snížený obsah fosfatidylcholinu, což vede k přítomnosti podobného množství lipidů obsahujících cholin v raftech a v okolní plazmatické membráně. Se sfingolipidy přednostně interaguje cholesterol, a to díky jejich struktuře a nasycenosti uhlovodíkových řetězců. Ačkoli ne všechny fosfolipidy v raftech jsou zcela nasycené, hydrofobní řetězce lipidů obsažených v raftech jsou více nasycené a pevněji uspořádané než lipidy v okolní dvojvrstvě. [4] Cholesterol v raftech funguje jako dynamické "lepidlo", a drží je tak pohromadě. [3] V lipidových raftech se cholesterol převážně nachází díky rigidnímu charakteru jeho sterolové skupiny, která zapadá mezi rovné nasycené acylové řetězce lipidů. [4] Důležitou vlastností membránových lipidů je jejich amfipatický charakter. Amfipatické lipidy mají polární hydrofilní skupinu a nepolární hydrofobní oblast. [6] Obrázek vpravo ukazuje tvar sfingomyelinu (převrácený kužel) a cholesterolu (kužel) a jejich hydrofobní a hydrofilní oblasti. Cholesterol má schopnost vmezeřit se mezi lipidy v raftu, a slouží tak jako molekulární vložka a vyplňuje prázdná místa mezi asociovanými sfingolipidy. [7]

Rietveld a Simons dali lipidové rafty v modelových membránách do spojitosti s nemísitelností uspořádané (Lo fáze) a neuspořádané (Ld nebo Lα fáze) tekuté fáze. [8] Příčina této nemísitelnosti je nejistá, ale má se za to, že nemísitelnost minimalizuje volnou energii mezi oběma fázemi.

Lipidové rafty mohou být při nízkých teplotách (např. 4 °C) z okolní plazmatické membrány extrahovány pomocí neiontových detergentů, jako jsou například Triton X-100 a Brij-98. Je-li takový detergent přidán k buňkám, fluidní plazmatická membrána se rozpustí, zatímco lipidové rafty zůstanou nerozpuštěny a mohou být extrahovány.

Lipidové rafty jsou často kvůli jejich složení a rezistenci vůči detergentům také nazývány GEMs (glycolipid-enriched microdomains) nebo DRM (detergent resistant membranes). [9] Nicméně platnost metodiky pracující s rezistencí raftů vůči detergentům byla zpochybněna, a to kvůli nejasnostem ohledně lipidů a proteinů a pozorování, že jsou schopné vyvolávat vznik pevných struktur tam, kde předtím nebyly. [10]

Až do roku 1982 bylo v souladu se Singer-Nicolsonovým modelem tekuté mozaiky, publikovaným v roce 1972, široce přijímáno, že fosfolipidy a membránové proteiny jsou v buněčných membránách náhodně rozmístěny. [4] [11] V 70.letech ale Stier & Sackmann a Klausner & Karnovsky s použitím biofyzikálních přístupů postulovali membránové mikrodomény. [12] [13] Tyto mikrodomény byly přisouzeny fyzikálním vlastnostem a organizaci lipidových směsí (Stier & Sackmann [12] a Israelachvili et al. [14] ). V roce 1974 vedl objev efektů teploty na chování membrány k návrhu "lipidových shluků" v membráně a v roce 1975 data naznačila, že by tyto shluky mohly být kvazikrystalické oblasti obklopené volněji rozptýlenými krystalickými lipidovými molekulami. V roce 1978 vedly rentgenové difrakční studie k dalšímu vývoji tohoto modelu a mikrodomény byly definovány jako "lipidy ve více uspořádaném stavu". V roce 1982 Karnovsky a spolupracovníci formálně stvrdili koncept lipidových domén v membránách. Karnovského výzkum ukázal heterogenitu v délce života 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrienu, což indikovalo, že v lipidovém prostředí membrány se nachází několik fází. [4] Jeden typ mikrodomén je tvořen cholesterolem a sfingolipidy. Biltonen, Thompson a jejich spolupracovníci ukázali, že se vytváří díky segregaci těchto lipidů do oddělené fáze. [15] Poté bylo ukázáno, že tyto membrány existují i v buněčných membránách. [16] Později se Kai Simons z Německa a Gerrit van Meer z Nizozemska znovu zaměřili na tyto membránové mikrodomény obohacené o lipidy, cholesterol, glykolipidy a sfingolipidy přítomné v buněčných membránách [17] a následně je pojmenovali jako lipidové rafty. Původní koncept raftů byl využit pro vysvětlení transportu cholesterolu z trans Golgi váčků na plazmatickou membránu, což bylo dále rozvinuto Simonsem a Ikonenovou. [18] V roce 2006 byly na symposiu (Keystone Symposium of Lipid Rafts and Cell Function) lipidové rafty definovány jako "malé (10–200 nm), heterogenní, velmi dynamické, na steroly a sfingolipidy bohaté domény, kompartmentalizující buněčné procesy. Malé rafty mohou být někdy stabilizovány a tvoří větší platformy pomocí protein-proteinových interakcí." V posledních letech se výzkum lipidových raftů snaží odpovědět na klíčové otázky, které vyvolávají kontroverzi v této oblasti a týkají se například velikosti a délky života raftů. [4]

Byly navrženy dva typy lipidových raftů: planární lipidové rafty (také nazývané jako nekaveolární nebo glykolipidové) a kaveoly. Planární rafty jsou definovány tím, že jsou kontinuální s rovinou plazmatické membrány (bez invaginace) a chybí u nich rozpoznávací morfologické znaky. Na druhé straně kaveoly tvoří invaginace plazmatické membrány, tvarem připomínající baňku, obsahují kaveolinové proteiny a jsou to nejsnadněji pozorované struktury v lipidových raftech. Kaveoliny jsou široce exprimovány v cévách v mozku, v endotelových buňkách, astrocytech, oligodendrocytech, Schwannových buňkách, dorsálních kořenových gangliích a neuronech hippocampu. Planární rafty obsahují flotillinové proteiny a nacházejí se v neuronech a leukocytech, kde nejsou přítomny kaveoly. Oba typy raftů mají podobné lipidové složení (jsou obohacené na cholesterol a sfingolipidy). Flotilliny a kaveoliny mají schopnost přivádět do lipidových raftů signální molekuly, a hrají tak důležitou roli například v signální transdukci neurotransmiterů. Tyto mikrodomény prostorově organizují signální molekuly, a tím usnadňují jejich interakce, které jsou nezbytné pro signální transdukci. Mohou ale také signální molekuly oddělovat, brání tedy jejich interakci a inhibují signalizaci. [19]

Signální transdukce na buněčné úrovni znamená proces, při kterém buňka převádí jeden druh signálu nebo stimulu na jiný. Přenos signálu nebo stimulu může být jednoduchý, asociovaný s molekulou receptoru. Komplexnější signální transdukce zahrnuje spřažení interakce ligand-receptor s mnoha dalšími intracelulárními ději. Tyto děje zahrnují fosforylace tyrosinovými kinázami a/nebo serin/threoninovými kinázami. [20] Specifita a přesnost přenosu signálu jsou pro buňky nezbytné k tomu, aby mohly efektivně reagovat na změny v prostředí. Toho je částečně dosaženo diferenciální lokalizací proteinů, které se účastní signálních drah. V plazmatické membráně může být této kompartmentalizace dosaženo pomocí lipidových raftů. [21] Jedním ze způsobů, jak můžeme uvažovat o lipidových raftech, je, že po aktivaci receptoru ligandem dochází ke shlukování malých raftů do větších signalizačních platforem. [22] Jestliže se aktivace receptoru odehrává v lipidovém raftu, je signalizační komplex chráněn před neraftovými molekulami, jako mohou být například membránové fosfatázy. Asociace proteinů s rafty tedy přivádí proteiny do nového mikro-prostředí, kde může být jejich fosforylační stav modifikován zde přítomnými kinázami, což může spouštět následnou signalizaci. [23] Lipidové rafty hrají roli v mnoha signálních procesech, jako je signalizace receptoru pro imunoglobulin E, antigenně specifického receptoru T a B lymfocytů, receptoru pro EGF, insulin a tak dále.

Signalizace receptoru pro imunoglobulin E Editovat

U signalizace receptoru pro imunoglobulin E byla poprvé přesvědčivě demonstrována úloha lipidových raftů v signální transdukci. [24] [25] [26] Důkazy pro tento fakt zahrnovaly: sníženou rozpustnost Fc-epsilon receptorů (FcεR) v Tritonu X-100 po prokřížení receptorů [24] , tvorbu shluků vizualizovatelných fluorescenční mikroskopií (detekce gangliosidů a GPI-kotvených proteinů) [27] [28] a inhibici signalizace IgE po depleci cholesterolu pomocí methyl-beta-cyklodextrinu. [29] Signalizace z receptoru pro IgE probíhá takto: IgE se váže na Fc-epsilon receptory (FcεR), které jsou svými Fc segmenty kotveny v plazmatické membráně žírných buněk a bazofilů. FcεR je tetramer, který se skládá z jednoho α, jednoho β a dvou γ řetězců. [26] Jedna molekula FcεR váže jednu molekulu IgE. α řetězec váže IgE, zatímco zbývající obsahují ITAM motivy (immune receptor tyrosine-based activation motifs). Naváže-li se potom oligomerní antigen na IgE molekuly navázané na svých receptorech, dochází k prokřížení jednoho nebo více těchto receptorů. Toto prokřížení vede k interakci s acylovanou nereceptorovou kinázou Lyn z rodiny Src, která fosforyluje receptorové ITAMy. Na tyto fosforylované ITAMy se pak váže kináza z rodiny Syk a iniciuje signální kaskádu. [24] [25] Syk může poté aktivovat další proteiny, například adaptorové z rodiny SLP-76, které přichází do raftu a amplifikují signál. [30]

T buněčná signalizace Editovat

T buněčný antigenně specifický receptor (TCR) je molekula nacházející se na povrchu T lymfocytů (T buněk). Skládá se z αβ-heterodimerů, CD3 (γδε) komplexu a ξ-homodimeru. Extracelulární části α- a β-podjednotek obsahují vazebná místa pro antigenní peptid prezentovaný na MHC molekulách na povrchu antigen prezentujících buněk. CD3 a ξ-podjednotky obsahují ve své intracelulární části ITAM motivy. MHC molekuly přivádí během signalizace dvě nebo více receptorů TCR k sobě. Toto prokřížení pak vede, podobně jako u IgE signalizace, k fosforylaci ITAMů kinázami z rodiny Src. [31] [32] Na fosforylované ITAMy se pak váže kináza ZAP-70 (podobně jako u signalizace IgE z rodiny Syk, ale jiný zástupce), což vede k její aktivaci, aktivaci adaptorové molekuly LAT a následné amplifikaci signálu. Dalším rozdílem mezi signalizací IgE a TCR je, že aktivace Lck po stimulaci TCR může vést k výraznějšímu klastrování raftů, a tedy k větší amplifikaci signálu. [33] [34] Jednou z možností negativní regulace signalizace TCR je vazba cytosolické kinázy Csk na protein asociovaný s rafty CBP. Csk pak může prostřednictvím inhibiční fosforylace inhibovat kinázy z rodiny Src. [35]

B buněčná signalizace Editovat

B buněčný antigenně specifický receptor (BCR) je tvořen membránově vázanou molekulou imunoglobulinu (mIg) a heterodimerem Igα/Igβ. Igα a Igβ obsahují ITAM motivy. Proces signalizace BCR je podobný jako u IgE a TCR. Lipidové rafty hrají ale také úlohu v mnoha dalších událostech podílejících se na aktivaci buněk B. Kromě signalizace BCR sem patří modulování signalizace koreceptory, signalizace CD40, endocytóza antigenu vázaného na BCR a jeho transport do pozdních endosomů, transport komplexů peptid-MHCII na povrch buňky a účast na prezentaci antigenu T buňce. [36]

Lipidové rafty se také uplatňují v ději zvaném raft-dependentní endocytóza, a to kaveolární nebo nekaveolární (obojí nezávislé na klatrinu).

Pro vznik kaveolárních endocytických váčků je důležitá schopnost proteinu kaveolinu vytvářet oligomery (14–16 molekul) pomocí jeho oligomerizační domény. To vede v plazmatické membráně ke vzniku mikrodomén bohatých na kaveolin. Zvýšení obsahu cholesterolu a vložení „scaffolding“ domény kaveolinu do membrány zde pak vede k expanzi kaveolární invaginace a vzniku endocytického váčku. Váček je od plazmatické membrány odštěpen pomocí proteinu dynamin II, který je lokalizován na krčku vznikajícího váčku. Tento druh endocytózy se uplatňuje například při transcytóze albuminu v endoteliálních buňkách nebo internalizaci insulinového receptoru v primárních adipocytech. [37]

Nekaveolární raft-dependentní endocytóza může být závislá nebo nezávislá na dynaminu. Na dynaminu závislou a klatrinu nezávislou endocytózou jsou například v lymfocytech konstitutivně internalizovány receptory pro interleukin-2, lokalizované v lipidových raftech. Naopak na dynaminu nezávislá endocytóza se podílí například na pinocytóze nebo na internalizaci CT-B v myších embryonálních fibroblastech. [37]

Lipidové rafty také vytvářejí signalizační platformy pro spouštění jak proapoptotických, tak protiapoptotických drah. Lipidové rafty mohou ovlivňovat důležité apoptotické signalizační události, jako je aktivace apoptotických receptorů, aktivace nebo deaktivace proteinových kináz a změna intracelulární koncentrace vápníku. Toho využívá řada protinádorových léčiv, která jsou schopná narušit integritu lipidových raftů, a tím spustit apoptózu u nádorových buněk. [38]

Lipidové rafty se také uplatňují v buněčné adhezi a migraci, což jsou děje nezbytné například pro invazi nádorových buněk. Bylo ukázáno, že změna koncentrace cholesterolu mění regulovanou membránovou lokalizaci molekuly CD44, která je nezbytná pro zvýšení adhezivity a migrace nádorových buněk. Organizace lipidových raftů také ovlivňuje funkci integrinů, které jsou důležité pro mezibuněčný kontakt a kontakt s extracelulární matrix. Lipidové rafty jsou také potřeba pro vznik invadopodií, například u buněk rakoviny prsu. Invadopodia jsou výběžky invazivních nádorových buněk, které zajišťují degradaci extracelulární matrix, a usnadňují tak buňkám migraci. [39]

Jeden z hlavních důvodů ke kontroverzi okolo lipidových raftů pramení z námitek ohledně studia raftů v živých buňkách, které se nenachází v termodynamické rovnováze. [19] Lipidové rafty jsou malé mikrodomény o velikosti pohybující se mezi 10 a 200 nm [4] , tedy pod rozlišovací schopností světelného mikroskopu, a je tak obtížné vizualizovat je přímo. V současné době jsou studovány syntetické membrány, jejichž používání má ale několik nevýhod. Za prvé, ve srovnání s biomembránami mají syntetické membrány nižší koncentraci proteinů. Také je obtížné modelovat interakce membrány s cytoskeletem, které jsou u biomembrán přítomny. Mezi další úskalí patří nepřítomnost přirozené asymetrie a nemožnost studovat membrány v nerovnovážných podmínkách. [4] [40] Navzdory těmto nedostatkům je fluorescenční mikroskopie pro studium lipidových raftů často používaná. Například jsou využívány fluorofory konjugované s B-podjednotkou choleratoxinu (CT-B), která se váže na složku raftů, gangliosid GM1. Používají se také lipofilní membránové barvy, které se buď dělí mezi lipidové rafty a okolní membránu, nebo mění své fluorescenční vlastnosti podle fáze membrány. Příkladem takové barvy je Laurdan. Rafty mohou být také značeny za pomoci exprese fluorescenčních fúzních proteinů, například Lck-GFP.

Jednou z nejpoužívanějších metod pro studium lipidových raftů je manipulace s cholesterolem. Možnostmi jsou sekvestrace (pomocí filipinu, nystatinu nebo amfotericinu), deplece a odstranění (pomocí methyl-beta-cyklodextrinu) nebo inhibice syntézy cholesterolu (pomocí inhibitorů HMG-CoA reduktázy). Tyto přístupy například umožňují pozorovat účinky snížení hladiny cholesterolu na signalizaci neurotransmiteru. [19]

Sharma a kolegové použili vysokorozlišovací mikroskopii v kombinaci s matematickým modelováním a ukázali, že se raftové proteiny shlukují do nanoklastrů s poloměrem 5–20 nm. Dále pak pomocí FRET (fluorescence resonance energy transfer) mikroskopie ukázali, že frakce (20–40 %) GPI-kotvených proteinů se shlukuje do klastrů o poloměru 4–5 nm a že každý tento klastr se skládá z několika mála různých GPI-kotvených proteinů. [41] Aby se zamezilo problémům s malou velikostí a dynamickou strukturou, používají se také chlazené citlivé CCD kamery, sledující pouze jednu částici, a TIRF (total internal reflection fluorescence) mikroskopie. To umožňuje zjistit míru difúze částic a ohraničení jejich pohybu. [42]

Jsou také používány další optické techniky: pomocí FCS / FCC spektroskopie (fluorescence correlation a cross-correlation spectroscopy) můžeme získat informace o mobilitě fluoroforu v membráně, FRET mikroskopie může detekovat úzkou blízkost fluoroforů a pomocí optické pinzety můžeme studovat viskozitu membrány. [19]

Dalšími metodami jsou AFM (atomic force microscopy) mikroskopie, SICM (scanning ion conductance microscopy) mikroskopie, duální polarizační interferometrie, nukleární magnetická rezonance (NMR), i když fluorescenční mikroskopie zůstává dominantní technikou. V budoucnu by mohly být problémy plynoucí z difrakčního limitu překonány superrozlišovací mikroskopií, jako je STED (stimulated emission depletion) mikroskopie, nebo dalšími druhy mikroskopie. [43]

Metody používané pro analýzu lipidových raftů dále zahrnují ELISA, western blotting a FACS. [44] [45] [46]

Navzdory velkému množství experimentů, využívajících několik metod, není zatím role lipidových raftů v buněčné signalizaci, transportu a struktuře jasná, a dokonce i samotná existence raftů je stále kontroverzním tématem. [47]

Mezi argumenty proti existenci lipidových raftů patří:

  • Mezi Lα a Lo fázi by mělo existovat hraniční napětí (line tension). To bylo pozorováno na modelových membránách, ale ne v živých systémech.
  • Neexistuje žádný konsensus ohledně velikosti lipidových raftů. Pohybuje se mezi 1 a 1000 nm.
  • Není známa doba existence lipidového raftu. I kdyby rafty existovaly, mohly by existovat jen velmi krátkou dobu, která by byla pro biologické procesy bezvýznamná.
  • Celá membrána může existovat v Lo fázi.

Protiargumentem proti poslednímu bodu je, že Lo fáze lipidových raftů je těsněji uspořádaná díky intermolekulárním vodíkovým můstkům mezi sfingolipidy a cholesterolem. [48]

Další spor se týká efektivity rozrušování lipidových raftů během experimentů. Pike a Miller poukazují na potenciální problém při využití deplece cholesterolu pro určení funkce raftu. [49] Říkají, že většina vědců používá pro depleci cholesterolu metodu, která narušuje i strukturu lipidu známého jako PI(4,5)P2. PI(4,5)P2 hraje důležitou roli v regulaci buněčného cytoskeletu, a jeho odstranění může tedy vést ke stejným výsledkům jako deplece cholesterolu, například k laterální difúzi proteinů v membráně. Kwik s kolegy tedy uzavřeli, že ztráta určité buněčné funkce po depleci cholesterolu nemusí být nutně způsobena rozrušením lipidových raftů, protože mohou být ovlivněny i procesy na raftech nezávislé. [50] [51] Také se myslí, že lipidové rafty jsou nějakým způsobem spojeny s proteiny. Edidin ale oponuje, že proteiny přitahují raftové lipidy přes své acylové řetězce. [52]


Membrane organization and lipid rafts

Cell membranes are composed of a lipid bilayer, containing proteins that span the bilayer and/or interact with the lipids on either side of the two leaflets. Although recent advances in lipid analytics show that membranes in eukaryotic cells contain hundreds of different lipid species, the function of this lipid diversity remains enigmatic. The basic structure of cell membranes is the lipid bilayer, composed of two apposing leaflets, forming a two-dimensional liquid with fascinating properties designed to perform the functions cells require. To coordinate these functions, the bilayer has evolved the propensity to segregate its constituents laterally. This capability is based on dynamic liquid-liquid immiscibility and underlies the raft concept of membrane subcompartmentalization. This principle combines the potential for sphingolipid-cholesterol self-assembly with protein specificity to focus and regulate membrane bioactivity. Here we will review the emerging principles of membrane architecture with special emphasis on lipid organization and domain formation.

Figures

Lipid shape and supramolecular organization…

Lipid shape and supramolecular organization (polymorphism). Phospholipids can be classified as cylinders (e.g.,…

Raft clustering and domain-induced budding.…

Raft clustering and domain-induced budding. Before clustering, proteins associate with rafts (red) to…

The tunable states of rafts.…

The tunable states of rafts. Resting-state rafts are dynamic, nanoscopic assemblies of raft…

Lipid modifications of proteins as…

Lipid modifications of proteins as determinants of raft association. ( A ) Examples…


Discovery and Evidence

The Singer and Nicolson fluid mosaic model of biological membranes was proposed in 1972. By the early 1980s it became clear that membranes lipids preferentially segregated into different phases under physiological conditions and therefore existed as a heterogeneous mixture in membranes 3 . Rafts were first discovered in the 1990s when a significant fraction of membrane remained resistant to Triton X-100 detergent at 4˚C 4 . However, there was still a question of whether the DRM was an artifact of the cold treatment. To answer this question, resonance energy transfer (RET) was measured in cells expressing two types of membrane associated fluorescent folate analogs, GPI anchored folate receptors and transmembrane anchored folate receptors 5 . The GPI anchored probe was predicted to localize to the DRM domains, while the transmembrane anchored probe was not. The GPI anchored probe&rsquos RET did not increase with increased density of the probe, suggesting that the probes were non-randomly clustered at a spatial distribution below the resolution of the microscope. The transmembrane anchored probe&rsquos RET increased linearly with increased density, suggesting that they were randomly distributed throughout the membrane. Also, when cholesterol was extracted from the membrane, the GPI anchored probes were found to be randomly distributed. This data suggests that the DRM rafts are in fact real.

Another key piece of evidence for the existence of rafts came from membrane protein cross-linking experiments 6 . Membrane proteins were cross-linked by aggregating a certain protein with an antibody and cross-linking nearby proteins with aldehyde fixatives. Membrane proteins associated with the DRM rafts were colocalized, while proteins not associated with the DRM rafts did not colocalize with raft proteins. The close proximity of raft-associated proteins suggests that the DRM rafts are real membrane microdomains.


References

Original articles

Baumgart, T. et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 3165–3170 (2007)

Baumgart, T., Hess, S. T. & Webb, W. W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature 425, 821–824 (2003)

Diaz-Rohrer, B. B. et al. Membrane raft association is a determinant of plasma membrane localization. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 8500–8505 (2014)

Komura, N. et al. Raft-based interactions of gangliosides with a GPI-anchored receptor. Nat. Chem. Biol. 12, 402–410 (2016)

Sezgin, E. et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat. Protoc. 7, 1042–1051 (2012)

Related article

Sezgin, E. et al. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 361–374 (2017)


Cleavage fragments of the third complement component (C3) enhance stromal derived factor-1 (SDF-1)-mediated platelet production during reactive postbleeding thrombocytosis

We hypothesized that the third complement component (C3) cleavage fragments (C3a and (des-Arg)C3a) are involved in stress/inflammation-related thrombocytosis, and investigated their potential role in reactive thrombocytosis induced by bleeding. We found that platelet counts are lower in C3-deficient mice in response to excessive bleeding as compared to normal littermates and that C3a and (des-Arg)C3a enhance stromal-derived factor-1 (SDF-1)-dependent megakaryocyte (Megs) migration, adhesion and platelet shedding. At the molecular level, C3a stimulates in Megs MAPKp42/44 phosphorylation, and enhances incorporation of CXCR4 into membrane lipid rafts increasing the responsiveness of Megs to SDF-1. We found that perturbation of lipid raft formation by statins decreases SDF-1/C3a-dependent platelet production in vitro and in an in vivo model statins ameliorated post-bleeding thrombocytosis. Thus, inhibition of lipid raft formation could find potential clinical application as a means of ameliorating some forms of thrombocytosis.


Key Points

Lipid rafts consist of dynamic assemblies of cholesterol and sphingolipids in the exoplasmic leaflet of the lipid bilayer.

Lipid rafts can include or exclude proteins selectively, and the raft affinity of a given protein can be modulated by intra- or extracellular stimuli.

They are too small to be seen by standard microscope techniques. It is also not possible to isolate lipid rafts in their native state. Detergent-resistant membranes, containing clusters of many rafts, can be isolated by extraction with Triton X-100 or other detergents on ice.

Raft association of proteins can be assayed by manipulating the lipid composition of rafts. If cholesterol or sphingolipids are depleted from membranes, lipid rafts are dissociated, and previously associated proteins are no longer in rafts.

There is great confusion in the nomenclature for lipid rafts, and Table 2 proposes a new nomenclature.

Rafts are involved in signal transduction. Crosslinking of signalling receptors increases their affinity for rafts. Partitioning of receptors into rafts results in a new micro-environment, where their phosphorylation state can be modified by local kinases and phosphatases, modulating downstream signalling.

Raft clustering could also be involved in signal transduction. Several rafts coalesce, resulting in amplification of the signal.

Some examples for such raft-dependent signalling processes are IgE signalling during the allergic response, T-cell activation and GDNF signalling.

Rafts are also necessary for Hedgehog signalling during development but the mechanism is very different. Hedgehog is a membrane-bound ligand and needs to be released from its cell of origin so it can signal to cells several layers away. It can be released from the cell when it is anchored in rafts through its cholesterol moiety.


CONCLUDING REMARKS

The advent of the concept of lipid rafts in 1997 (19) has changed our view of the role cellular membranes in cell signaling regulation. Over the last two to three decades, a great deal of evidence has led to the conclusion that these membrane domains act as platforms for the recruitment of signaling processes that regulate cell fate, thus suggesting the presence of different types of lipid rafts, including survival- and apoptotic-promoting rafts ( Fig. 3 ). Increasing evidence shows that membrane rafts provide platforms where a number of receptors and downstream signaling molecules are brought together, thus facilitating and fostering their interaction in a transient manner and eventually leading to the onset of a potent signaling pathway. Cancer cells show high levels of intracellular cholesterol and lipid rafts as compared with their non-tumorigenic counterparts, thus suggesting that formation of cholesterol-rich rafts is potentiated in tumor cells. Proteins and signaling processes involved in cancer development and progression, such as the IGF system and the PI3K/AKT pathway, as well as in metastasis (MUC1, CD44), are dependent on or modulated by lipid rafts ( Fig. 3 ). This could be an explanation for the higher cholesterol and raft levels found in cancer cells, thus favoring their cell survival and dissemination. However, the presence of lipid rafts can also become an Achilles’ heel for cancer cells. Evidence collected in the last two decades highlights the critical role of the recruitment of death receptors and downstream signaling molecules in lipid rafts for mounting an apoptotic response ( Figs. 3 , ​ ,4) 4 ) as well as the crucial role of the so-called CASMERs, recruiting and concentrating death receptors and downstream signaling molecules and acting as the linchpin from which a potent death signal is launched ( Fig. 5 ). Cancer is perhaps one the most complicated diseases to treat because of its genetic heterogeneity and complexity, and different tumors show distinct types of genetic alterations, oncogenic signaling, metabolic features, and epigenetic changes, which are responsible for tumorigenesis, and additional mutations or resistance processes can come up along the course of the disease, thus driving tumor progression. In this regard, an appealing approach to combat cancer would be to set in motion the apoptotic machinery of the cancer cell to induce its own demise (255, 256). Because CASMER formation directly recruits and triggers the death receptor apoptotic machinery, the potential for CASMER-based therapies seems very promising in the treatment of cancer, in a rather general way, as well as in other pathologies where stimulation of apoptosis is defective (255, 256). CASMER-mediated direct activation of apoptosis opens a new avenue in cancer therapy, which would be apparently independent of tumor suppressor genes (e.g., p53) and sensors, which are frequently mutated in cancer (82, 255). Nevertheless, a putative limitation could reside in the feasibility to generate CASMER and in its heterogeneity in both composition and ability to generate apoptotic signals in different malignant cell populations. Ideally, optimization of this raft-mediated approach of promoting cancer cell suicide by apoptosis could be useful for a large variety of different tumors. Membrane rafts housing survival signaling might be important for cancer development and drug-resistance, and membrane rafts housing apoptotic signaling might provide a new avenue to promote cell death in cancer cells. Membrane rafts are heterogeneous in terms of their protein and lipid contents, leading to the existence of functionally distinct raft populations (295, 296), acting as signaling hubs that can cross-talk or coalesce to modulate cell function. Furthermore, the protein profile of membrane rafts varies both spatially and temporally, and actin cytoskeleton, posttranslational protein modifications as well as protein-protein and protein-lipid interactions play pivotal roles in generating the precise raft architecture. Membrane rafts can also be localized to different regions of the cell and can behave as cargo wagons playing a critical role in the communication between different cellular compartments, transporting molecules and modulating the function of each subcellular organelle. The fact that the antitumor ether lipid edelfosine can reorganize membrane raft composition, displacing PI3K/AKT survival signaling from rafts in MCL, leading to AKT inhibition, while it induces recruitment of Fas/CD95 and downstream cell death signaling molecules in rafts, suggests that modulation of survival and apoptotic signaling routes via rafts might be a promising and appealing approach, as well as a pharmacologically viable strategy, for cancer therapy. However, the physicochemical principles responsible for compartmentalization in membrane rafts and the molecular mechanisms by which they are functionalized remain to be elucidated. On these grounds, several open questions in the membrane domain field need to be answered before we move forward implementing the above mentioned raft-mediated therapeutic approach. What are the mechanisms that drive raft formation and determine their properties? How many different raft subtypes can coexist in a cancer cell type? What is the role of complex lipidome in the generation of different membrane rafts? What is the role of cholesterol and membrane lipidomics in spatial raft coalescence and raft-mediated connections between different subcellular organelles? How is membrane compartmentalization integrated into cellular signaling? Are survival-promoting rafts different from the apoptotic-promoting rafts? Can these survival- and apoptotic-promoting rafts interact, influence, or transform each other? How are these raft-mediated signaling processes turned on and off? What are the mechanisms involved in the recruitment of Fas/CD95 and downstream signaling molecules in lipid rafts leading to a functional cell death-promoting raft platform? Although many questions remain to be solved, modulation of survival and apoptotic signaling through membrane rafts could be a promising and appealing approach in the treatment of cancer, highlighting the potential of lipid rafts as a novel therapeutic target in cancer therapy.


Watch the video: Lipid Rafts (January 2022).